Reaktywne formy tlenu (ROS), leukocytospermia i jakość nasienia

Na przestrzeni lat starano się udowodnić dwoistość natury leukocytów i substancji przez nie wydzielanych w męskim układzie rozrodczym. Z  jednej strony leukocyty mogą brać udział w eliminacji nieprawidłowych bądź martwych plemników z nasienia [1-3], a podstawowe stężenie ROS jest niezbędne podczas niektórych reakcji związanych z zapłodnieniem [4, 5], z drugiej natomiast strony nadmiar produkowanych ROS prowadzi do stresu oksydacyjnego, który jest toksyczny dla plemników i może upośledzać płodność [1].

Małe stężenie reaktywnych form tlenu jest nieodłącznym składnikiem potrzebnym do prawidłowego przebiegu procesów fizjologicznych męskich komórek rozrodczych. Podczas różnicowania się komórek gametogenicznych, ROS biorą udział w kondensacji DNA oraz poprzez pobudzanie dwóch przeciwstawnych do  siebie procesów, którymi są apoptoza i proliferacja, stanowią część systemu regulującego produktywność spermatogenezy. Wolne rodniki tlenowe, a  w  szczególności O₂^∙- oraz H₂O₂ są niezbędne dla kapacytacji oraz reakcji akrosomalnej – procesów zachodzących w przebiegu nabywania przez plemniki zdolności do zapłodnienia komórki jajowej. W zwiększeniu ruchliwości plemników, potrzebnej do penetracji osłonki przejrzystej i fuzji gamety męskiej i żeńskiej, rolę odgrywa NO. ROS w procesie zapłodnienia odgrywają również rolę jako przekaźniki informacji do komórek oraz biorą udział w interakcjach międzykomórkowych, przez co są w stanie regulować procesy metaboliczne plemników [4, 6].

Z drugiej strony pod wpływem nasilonego lub długo utrzymującego się niekontrolowanego wzrostu stężenia ROS w przebiegu leukocytospermii, dochodzi do toksycznego dla komórek rozrodczych „szoku tlenowego” [7]. Prowadzi to do kilku synergistycznych mechanizmów, których efektem jest zaburzenie kolejnych etapów procesu zapłodnienia, osłabienie plemników oraz wystąpienie szeregu nieprawidłowości w nasieniu, do których możemy zaliczyć: oligozoospermię (zaburzenia koncentracji plemników w nasieniu) [5] i/lub asthenozoospermię (zaburzenia ruchliwości), obniżenie aktywności akrosomu, spadek integralności DNA plemników, uszkodzenie różnego rodzaju białek w nasieniu, zmiany w morfologii plemników [5, 6, 8-12] oraz pojawienie się w nasieniu przeciwciał anty-plemnikowych [6, 10].

Efekt działania leukocytów na paramenty nasienia jest dość złożony co potwierdza wiele badań [7, 13]. Podatność plemników na stres oksydacyjny wynika z obecności na ich błonie komórkowej nienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA-polyunsaturated fatty acids), a  metylenowe grupy występujące pomiędzy podwójnymi wiązaniami w łańcuchu węglowym są miejscami, gdzie cząsteczki wodoru mogą być łatwo usunięte przez ROS [4, 5]. Nagromadzenie się zmodyfikowanych przez ROS lipidów prowadzi do obniżenia płynności błon (ich zmieniona struktura ma niekorzystny wpływ na strukturę receptorów błonowych, białek enzymatycznych i transportowych) oraz do zaburzenia prawidłowej funkcji i morfologii plemników. Główne niekorzystne działanie na białka przypisuje się takim rodnikom jak: OH^∙, O₂^∙-, H₂O₂, HOCl i NO^∙ [6, 14]. W leukocytospermii pod wpływem ROS dochodzi do zmniejszenia procentowego udziału WKT (wolne kwasy tłuszczowe) w błonie komórkowej plemników co koreluje ze wzrostem odsetka nieprawidłowych morfologicznie plemników [6, 15] oraz spadkiem ruchliwości [4, 6, 8, 10, 15, 16] i przeżywalności gamet męskich [6]. Mafhouz i wsp. [14] wykazali, że w przypadku zwiększonej produkcji ROS następuje spadek żywotności plemników (wzrost odsetka martwych plemników w próbkach) na skutek pobudzenia w nich reakcji apoptozy.

Peroksydacja lipidowa może także w konsekwencji prowadzić do utraty aktywności mitochondrialnej oraz wzrostu fragmentacji DNA jądra plemników [4, 5, 15]. Integralność DNA jest niezbędna dla dokładnej transmisji informacji genetycznej. Wykazano, że ten parametr ma   ogromne znaczenie dla zapłodnienia i prawidłowego rozwoju zarodka [17]. Nadmierna produkcja ROS może prowadzić do pośredniej aktywacji endonukleaz rozkładających DNA oraz do bezpośredniego uszkodzenia DNA, poprzez utlenienie zasad DNA (głównie guaniny), uszkodzenia reszt cukrowych, tworzenie wiązań poprzecznych DNA-białko oraz oddziaływanie z nićmi DNA, co prowadzi do powstania przerw w jednej lub obu niciach DNA [5, 6, 17]. Uszkodzenia w DNA mogą prowadzić do mutagenezy, a tym samym powstania nieodwracalnych nieprawidłowości w materiale genetycznym plemnika [9]. Nieprawidłowości te pozostają trwałe i nie zanikają nawet pomimo obniżenia liczby leukocytów w nasieniu pacjentów podczas pomyślnego leczenia leukocytospermii [15]. Podkreśleniem niekorzystnego działania ROS mogą być badania Seleh i wsp. [8], które wykazały znaczący wzrost uszkodzeń DNA plemników w próbkach z leukocytespermią w porównaniu do próbek o dopuszczalnej ilości leukocytów. Uszkodzenia oksydacyjne mogą zajść również w mitochondrialnym DNA (mtDNA) [12]. Może to zaburzać czynność mitochondriów plemników zawartych we wstawce, które stanowią źródło energii niezbędnej do poruszania witką [6].

Do uszkodzenia plemników przez leukocyty może dochodzić za pośrednictwem proteaz i cytokin przez nie wytwarzanych [1, 10] lub poprzez zwiększenie ilości limfocytów T-helper 1 [1]. Kiedy neutrofile stają się aktywne i dochodzi do wybuchu tlenowego wraz z  powstawaniem ROS generowane są również proteazy np. elastazy wpływające na spadek ruchliwości plemników i integralności DNA. Na uwagę w tym aspekcie zasługują również makrofagi. Za marker aktywności makrofagów uznawana jest neopteryna, która jest uwalniana z makrofagów/monocytów. Im więcej neopteryny jest uwalniane z makrofagów tym większe ich zdolności do produkcji ROS. Stwierdza się, iż stężenie elastazy i neopteryny jest znacznie wyższe u niepłodnych niż płodnych mężczyzn [18]. Inną substancją niekorzystnie wpływającą na morfologię plemników jest kinaza keratynowa, wzrost ilości której jest dodatnio skorelowany z indukcją uszkodzenia oksydacyjnego [15], co wiąże się z powstawaniem takich zaburzeń jak obecność resztkowej cytoplazmy w obrębie wstawki plemnika [19]. Według Aziz’a i wsp. [15] resztkowa cytoplazma u pacjentów z leukocytospermią może być skutkiem uszkodzenia funkcji komórek Sertoliego. Zarówno neutrofile jak i makrofagi mają potencjał do wytwarzania znaczących szkód w plemnikach przez generację ROS i  reaktywnych form azotu, uwalnianie enzymów hydrolitycznych i peptydów cytotoksycznych (defensyn) oraz wywoływanie wzmożonej reakcji apoptozy (aneksyna V) w plemnikach za pośrednictwem cytokin [18].

Omawiając podwójny efekt działania leukocytów oraz ich produktów wydzielania należy pamiętać, że zależy on nie tylko od stężenia leukocytów w nasieniu, ale także od czynników które spowodowały ich podwyższony poziom, warunków pobierania nasienia, a także sposobu oceny krwinek białych w nasieniu. Lackner i wsp. [16] badali związek pomiędzy liczbą leukocytów a morfologią i ruchliwością plemników w zależności od stężenia leukocytów w nasieniu. Według autorów w próbkach < 1 mln leukocytów na ml nasienia zaobserwowano wzrost prawidłowej morfologii oraz większy odsetek plemników z ruchem postępowym, natomiast odwrotne wyniki odnotowali dla próbek o liczbie leukocytów ≥ 1 mln na ml nasienia. Podkreślili jednak, że ich badania miały charakter retrospektywny i z tego względu wyniki ich analiz mogą być obarczone pewnym błędem. Bardziej autorytatywnymi badaniami potwierdzającymi dwoistość działania leukocytów wydają się te opublikowane przez Mahfouz’a i wsp. [14], będące prospektywną analizą, podczas której brano pod uwagę uwarunkowania środowiska oraz przeprowadzano badania w konkretnej grupie pacjentów wraz z utworzeniem grupy kontrolnej. Przydatnymi badaniami, by  potwierdzić ważność innych czynników niż tylko wzrostu liczby leukocytów w  etiologii zaburzonej morfologii plemników są badania przeprowadzone przez Aziz’a i wsp. [15], którzy dowiedli, że nie ma statystycznie istotnych różnic w  morfologii plemników u niepłodnych mężczyzn zarówno w grupie pacjentów z  leukocytospermią, jak i bez niej, co może wskazywać na istnienie innych czynników powodujących zaburzenia w morfologii plemników a tym samym spadku płodności mężczyzn. Były to jedne z pierwszych badań oceniających związek wskaźnika deformacji plemników – SDI (ang.: sperm deformity index), stosując surowe kryteria morfologiczne (wg Krugera) z leukocytospermią w zróżnicowanej grupie osób o różnym potencjale płodności.

Na przestrzeni lat prowadzone były badania sugerujące zasadność obniżenia granicy koncentracji leukocytów wykorzystywanej przez WHO do określenia leukocytospermii (według WHO 2010 granica ta wynosi ≥ 1 mln/ml nasienia), sugerując granicę na poziomie 0,1 mln [20], 0,2 mln [1, 21], czy 0,5 mln leukocytów na ml nasienia [22]. Mogło to wynikać z różnych projektów badań przeprowadzonych przez tych autorów, w tym różnych metod oznaczania leukocytów oraz kryteriów oceny morfologii plemników.

Szkodliwy wpływ leukocytów zależy od ich rodzaju w ocenianym nasieniu [15]. Inny wpływ na jakość nasienia mogą mieć aktywne formy leukocytów oraz te, które produkują ROS w większych ilościach, a inny leukocyty fagocytujące, usuwające z nasienia plemniki obumarłe i nieprawidłowe..

Dyskusja na temat charakteru działania leukocytów ma poważne konsekwencje dla diagnostyki andrologicznej, jak również dla leczenia niepłodności męskiej. W odniesieniu do diagnostyki, z pewnością nie jest wystarczające opieranie swoich badań jedynie o tzw. parametry klasyczne nasienia, jak np. koncentracja plemników, ich żywotność i ruchliwość oraz prawidłowa morfologia plemników. Warto podkreślić, iż według niektórych autorów badań [4, 16] negatywny wpływ ROS występujących w  nasieniu produkowanych przez leukocyty zależy w dużej mierze od całkowitej zdolności antyoksydacyjnej (TAC – total antioxidant capacity) w nasieniu, czyli od   równowagi między ROS, a mechanizmami obrony przed związkami utleniającymi. Sugeruje się, iż szkodliwe działanie substancji wydzielanych przez leukocyty następuje w momencie ich przewagi w stosunku do substancji układu antyoksydacyjnego. Z uwagi na indywidualne różnice w tym parametrze, oprócz wykonywanych obecnie testów czynnościowych, Henkel i wsp. [4] sugerują wprowadzenie do diagnostyki niepłodności porównania oceny poziomu ROS, jak i całkowitej zdolności antyoksydacyjnej (TAC) w ejakulacie. Jednakże możliwości rozszerzenia tej diagnostyki są ograniczone m. in. ze wzglądu na wysoki koszt zaproponowanych badań. Kolejną przeszkodę może stanowić profil laboratoriów, które mogą być nieprzystosowane do prowadzenia tego typu badań oraz złożoność samych analiz. Pomimo ograniczeń koncepcja wprowadzenia porównania oceny poziomu ROS, jak i całkowitej zdolności antyoksydacyjnej do rutynowej diagnostyki mogłaby zarówno pomóc wyjaśnić rozbieżności co do wpływu i znaczenia ROS, a co za tym idzie i obecności leukocytów w nasieniu, a także umożliwić lepszą interpretację wyników konkretnego pacjenta, w celu określenia jego potencjału płodności oraz wdrożenia ewentualnej terapii.

Ze względu na ambiwalentne funkcje leukocytów i ich produktów wydzielania na fizjologię plemników, jak również wyjątkowy charakter męskich komórek płciowych, konieczne jest przeprowadzenie oceny ryzyka i korzyści wynikających z ich podwyższonej ilości. Dlatego też potrzebne są badania, których celem będzie określenie tej nie do końca uzgodnionej granicy oddzielającej korzystny i szkodliwy poziom obecności leukocytów w nasieniu.

Gdzie można wykonać badanie ROS w nasieniu: kliknij tutaj

Opracowanie: Marcelina Kwaśniak (mgr analityki medycznej)

Na podstawie:

1. Punab, M., et al., The limit of leucocytospermia from the microbiological viewpoint. Andrologia, 2003. 35(5): p. 271–278.
2. Kiessling, A.A., et al., Semen leukocytes: friends or foes? Fertility and Sterility, 1995. 64(1): p. 196-8.
3. Tomlinson, M.J., et al., The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes? Human Reproduction 1992. 7(4): p. 517-22.
4. Henkel, R., Leukocytes and oxidative stress: dilemma for sperm function and male fertility. Asian Journal of Andrology, 2011(13): p. 43–52.
5. Fariello, R.M., et al., Effect of leukocytospermia and processing by discontinuous density gradient on sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity. Journal Assist Reprod Genet, 2009. 26(2-3): p. 151-7.
6. Frączek, M. and M. Kurpisz, System redoks w nasieniu męskim i peroksydacyjne uszkodzenia plemników. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 2005. 59: p. 523-534.
7. Thomas, J., et al., Increased polymorphonuclear granulocytes in seminal plasma in relation to sperm morphology. Human Reproduction, 1997. 12(11): p. 2418-21.
8. Saleh, R., et al., Leukocytospermia is associated with increased reactive oxygen species production by human spermatozoa. Fertility and Sterlity, 2002. 78(6): p. 1215-1224.
9. Comhaire, F.H., et al., Mechanisms and effects of male genital tract infection on sperm quality and fertilizing potential: the andrologist’s viewpoint. Human Reproduction Update, 1999. 5(5): p. 393-8.
10. Wolff, H., The biologic significance of white blood cells in semen. Fertility and Sterilily, 1995. 63(6): p. 1143-57.
11. Arata de Bellabarba, G., et al., Nonsperm cells in human semen and their relationship with semen parameters. Archives of Andrology, 2000. 45(3): p. 131-6.
12. Lemkecher, T., et al., Leucocytospermia, oxidative stress and male fertility: facts and hypotheses. Gynécologie Obstétrique & Fertilité 2005. 33: p. 2-10.
13. Rusz, A., et al., Influence of urogenital infections and inflammation on semen quality and male fertility. World Journal of Urology, 2011: p. [w druku].
14. Mahfouz, R., et al., Sperm viability, apoptosis, and intracellular reactive oxygen species levels in human spermatozoa before and after induction of oxidative stress. Fertility and Sterility, 2008. 93(3): p. 814-821.
15. Aziz, N., et al., Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertlility and Sterility, 2004. 82(3): p. 621-7.
16. Lackner, J., et al., The association between leukocytes and sperm quality is concentration dependent. Reproductive Biology and Endocrinology, 2010: p. 8-12.
17. Erenpreiss, J., et al., Effect of Leukocytospermia on Sperm DNA Integrity: A Negative Effect in Abnormal Semen Samples. Journal of Andrology, 2002. 23(5): p. 717-23.
18. Tremellen, K. and O. Tunc, Macrophage activity in semen is significantly correlated with sperm quality in infertile men. International Journal of Andrology, 2010. 33(6): p. 823-31.
19. WHO, WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen. 2010: World Health Organization.
20. Henkel, R., et al., Effect of reactive oxygen species produced by spermatozoa and leukocytes on sperm functions in non-leukocytospermic patients. Fertility and Sterilily, 2005. 83: p. 635- 642.
21. Oborna, I., et al., Reactive ocygen species in human semen in relation to leucocyte contamination. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký, Olomouc Czech Republic, 2009. 53(1): p. 53-58.
22. Sharma, R., et al., Relationship Between Seminal White Blood Cell Counts and Oxidative Stress in Men Treated at an Infertility Clinic. Journal of Andrology, 2001. 22(4): p. 575-83.

https://badanie-nasienia.pl/laboratoria/laboratorium-diagnostyki-edyta-koziel-ksiazek/